嘧啶核苷酸的生物合成过程首先从尿苷三磷酸（UMP）的合成开始，随后UMP通过特定的酶促反应衍生出胞嘧啶核苷酸（CMP）和脱氧尿苷三磷酸（dTMP）。由于嘧啶环的化学结构相对简单，其合成途径也较为直接，没有复杂的分支代谢。相比之下，嘌呤核苷酸的合成过程中存在一个特殊的分支，即组氨酸合成时释放的氨基甲酰基转移为AICAR（氨基咪唑核苷酸），这一过程可视为代谢途径的一个旁路。
UMP合成途径。引自themedicalbiochemistrypage
在UMP的合成过程中，涉及到了两种重要的分子：氨基甲酰磷酸（CP）和磷酸核糖焦磷酸（PRPP）。氨基甲酰磷酸不仅是尿素循环中的关键中间产物，同时在嘌呤、组氨酸和色氨酸的合成中扮演重要角色。然而，这两种分子在嘧啶合成中的使用方式与以往有所不同。
PRPP在嘌呤合成中充当起始的“载体分子”，整个嘌呤环的构建都是在磷酸核糖骨架上完成的。而在UMP的合成中，磷酸核糖的参与发生在较晚的阶段，嘧啶环的合成实际上是从氨基甲酰磷酸开始的。在此过程中，催化氨基甲酰磷酸合成的关键酶是氨基甲酰磷酸合成酶2（CPS-2），该酶位于细胞质中。而在尿素循环中发挥作用的CPS-1则位于线粒体内。
细胞质中的氨基甲酰磷酸合成。引自themedicalbiochemistrypage
CPS2能够催化谷氨酰胺与碳酸氢根反应生成氨基甲酰磷酸，并在此过程中消耗两个ATP分子。与CPS1相比，虽然直接消耗的能量相同，但CPS1的底物是氨气。由于谷氨酰胺的合成本身就需要消耗ATP，因此CPS2的反应总体上能量消耗更高。然而，这种机制的优势在于能够摆脱对氨气的依赖，使得细胞质在氨浓度较低的情况下仍能进行有效的嘧啶合成。
对于人体而言，这两种CPS酶还存在一个显著的区别：CPS1是一个独立的蛋白质分子，而CPS2则是三功能蛋白CAD（氨基甲酰磷酸合成酶-天冬氨酸转氨甲酰酶-二氢乳清酸酶）的一部分。CAD将催化此途径前三步反应的酶活性融合在一条肽链中，因此被称为CAD。
人体CAD基因结构与反应机制。引自Structure. 2016 Jul 6;24(7):1081-94.
这种多酶融合体的设计显著提高了催化效率，也反映了生物进化的趋势。哺乳动物的脂肪酸合酶（FAS）也采用了类似的进化策略。在原核生物中，ATCase（天冬氨酸转氨甲酰酶）活性同样存在多种形式：有些生物的ATCase活性由独立的催化亚基三聚体承担，而另一些生物则带有调节亚基或与DHOase（二氢乳清酸酶）结合。
不同原核生物的ATCase结构。引自Structure. 2016 Jul 6;24(7):1081-94.
ATCase活性负责催化氨基甲酰磷酸与天冬氨酸的反应（氨基甲酰磷酸可视为氨基甲酰基的活性形式），生成氨基甲酰天冬氨酸。PALA（N-膦酰基乙酰基-L-天冬氨酸）作为一种过渡态类似物，能够抑制CAD，因此被用作抗肿瘤药物。
DHOase活性则催化氨基甲酰天冬氨酸（CA）两端的羧基和氨基反应，生成闭环的二氢乳清酸（DHO）。DHO随后被二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）催化脱氢，生成乳清酸（orotate）。乳清酸与PRPP反应生成乳清苷酸（OMP），再脱羧生成UMP。
后两步反应同样由一个双功能酶催化，其N端结构域具有乳清酸磷酸核糖基转移酶活性，C端具有OMP脱羧酶活性，合称为UMP合成酶（UMPS）。
尿嘧啶胺化可以生成胞嘧啶，但这一反应只能在核苷三磷酸（NTP）水平上进行。因此，UMP首先与两分子ATP反应生成UTP，然后在CTP合成酶（CTPS）的催化下与谷氨酰胺和ATP反应，生成CTP。
CTP的合成。引自themedicalbiochemistrypage
合成DNA所需的脱氧核糖核苷酸均由相应的核糖核苷二磷酸（NDP）还原得到，即由NDP还原生成dNDP。核糖核苷酸还原酶（Ribonucleotide reductase，RNR）是DNA合成和修复的关键酶，在调节DNA合成的总速率中发挥着核心作用。
RNR通过自由基机制进行催化，根据产生自由基的方式可分为三种类型：第一类来自酪氨酸残基，第二类来自腺苷钴胺素，第三类来自糖基。RNR完成催化后，其关键巯基会形成二硫键，需要被还原为自由巯基。最终电子供体均为NADPH，但中间的电子传递涉及两个系统：硫氧还蛋白系统（TRX）和谷氧还蛋白系统（GRX）。目前的研究推测这两个系统之间可以相互备份（World J Biol Chem. 2014 Feb 26; 5(1): 68–74.）。
核糖核苷酸还原酶系统。引自themedicalbiochemistrypage
DNA所需的胸腺嘧啶是由尿嘧啶经过甲基化生成的，这一过程在dUMP上进行。胸腺嘧啶核苷酸合成酶（TYMS）催化这一反应，以甲叉四氢叶酸为甲基供体，生成dTMP。转甲基后，四氢叶酸（THF）生成了二氢叶酸（DHF），需要由二氢叶酸还原酶（DHFR）催化其再生。dUMP可以通过UDP还原、脱磷酸生成，也可以由dCMP脱氨生成。
dTMP的合成。引自themedicalbiochemistrypage
嘧啶核苷酸合成还存在补救途径。尿嘧啶可以与PRPP反应生成UMP，也可以与1-磷酸核糖反应生成尿苷，再被尿苷激酶催化生成UMP。胞嘧啶不能与PRPP直接反应，但胞苷可以通过尿苷激酶催化生成CMP。碱基和脱氧核糖-1-磷酸可以通过磷酸化酶合成脱氧核糖核苷，再由脱氧核糖核苷激酶生成脱氧核糖核苷酸。
一些辅酶也属于核苷酸衍生物。NAD的合成始于烟酸与PRPP的反应，生成烟酸单核苷酸，再与ATP缩合生成烟酸腺嘌呤二核苷酸，最后由谷氨酰胺酰胺化生成NAD。NAD激酶可以催化其生成NADP。
FAD的合成始于黄素先与ATP生成黄素单核苷酸（FMN），再与ATP生成FAD。辅酶A的合成始于泛酸先与ATP生成4-磷酸泛酸，再与半胱氨酸缩合并脱羧生成4-磷酸泛酰巯基乙胺，与ATP缩合成脱磷酸辅酶A，最后被ATP磷酸化成辅酶A。