生物素衍生物NHS-Biotin是最常用的胺反应性生物素，用于蛋白质和其他生物分子的修饰。这种伯胺偶联剂已成功应用于体内，特异性标记大肠杆菌的细胞包膜蛋白。它主要标记外膜、周质和内膜蛋白，以及特定的内膜标记蛋白（Tet-LacZ）。
图1展示的是NHS-Biotin的化学结构。
关于反应原理，生物素与抗生物素蛋白之间的牢固结合已经被广泛利用于高灵敏度分析中。由于生物素与抗生物素蛋白的结合稳定性常数极高（10^15），远超过抗原-抗体反应的常数，所以一旦生物素与抗生物素蛋白结合，就不会在生理条件下脱落。由于生物素具有羧基的小分子特性，可以方便地进行化学修饰，而且可以在不损害蛋白质等活性的情况下进行标记。已经研发出多种生物素化合物作为免疫测定的标记剂。NHS-Biotin通常利用其活性酯基与蛋白质的氨基（NH2）结合。
图2描绘了NHS-Biotin与蛋白质氨基结合的过程。
对于蛋白质的生物素标记操作方法，首先需要将蛋白质溶解在10mmol/l的Bicine Buffer（pH8.5）中，制成蛋白质溶液。然后加入生物素标记试剂溶液，蛋白质与生物素标记试剂的混合摩尔比为1:2-1:10。充分混合后，在水浴恒温摇床（25℃）中培养2-4小时。
关于标记蛋白质的凝胶过滤及纯化，首先需要将层析柱的盖子打开，并丢弃填充液。然后用PBS分数次洗脱，每根层析柱收集大约10ml的洗脱液，使凝胶达到平衡。接下来，用移液器吸取500l的标记好的蛋白质溶液加入到层析柱中，并丢弃此时的流出液。最后在层析柱的出口处放置一个2ml的样品管，加入1ml PBS，收集流出的生物素标记蛋白质。
以上操作步骤都来自于biofount范德生物的指南（货号：YZM018905）。
