在生物医学和生命科学的研究领域中，免疫组化技术占据着核心地位，它不仅是疾病诊断的重要工具，还在分子生物学探索和药物创新过程中发挥着关键作用。
这项技术通过借助抗体与特定抗原之间的高度特异性识别机制，能够精确地确定目标蛋白在组织或细胞内的存在位置、表达性质以及定量分析。本文将详细阐述免疫组化技术的核心原理、广泛的应用场景、主要的检测目标，以及常见的技术问题与实用建议。
01技术概述
免疫组化（IHC）是一种在组织学或细胞学层面上检测特定抗原存在性的分析方法。它基于抗体与目标抗原之间的高度特异性结合特性，使我们能够可视化这些抗原在组织切片中的分布位置，并对其进行定性和相对定量的研究。该技术的关键环节包括首先使用特异性识别目标蛋白的抗体进行结合，然后通过化学显色方法将这些抗体的结合位点显现出来，从而实现对组织或细胞中未知抗原的定性、定位和相对定量分析。
02应用领域
免疫组化技术在临床病理学研究中具有不可替代的作用，特别是在处理复杂病例、进行疾病诊断和鉴别诊断方面展现出显著优势。其应用范围广泛，涵盖了：肿瘤的确诊与类型区分、肿瘤原发部位的确定、组织病理学分类的深入分析、组织类型的鉴定，以及通过多种标志物结合免疫组化方法对软组织肿瘤进行精确诊断，甚至能够发现微小的转移病灶等。
在科研领域，免疫组化技术不仅可用于观察组织形态学特征，还可以检测靶标在细胞和亚细胞层面的定位情况，以及评估蛋白质表达的丰度等。
03检测材料
该技术主要应用于组织样本的处理，包括石蜡包埋切片（常规病理切片和组织芯片）、冷冻切片以及涂片。其中，石蜡切片是免疫组化中最常用和基础的一种检测方法，因为它能够有效保持组织结构的完整性，支持连续切片操作，便于进行多指标染色的对照观察，并且具有较长的保存期限。
然而，在制备石蜡切片的过程中，蛋白质可能因为固定过程而发生交联反应，从而影响抗体与抗原的结合效果。为了减轻这一影响，通常需要进行抗原修复步骤。
04实验流程
具体步骤（以石蜡切片为例）
1）、石蜡切片脱蜡至水：依次将切片置于环保型脱蜡剂Ⅰ中处理10分钟——环保型脱蜡剂Ⅱ中处理10分钟——环保型脱蜡剂Ⅲ中处理10分钟——无水乙醇Ⅰ中清洗5分钟——无水乙醇Ⅱ中清洗5分钟——无水乙醇Ⅲ中清洗5分钟——蒸馏水清洗。
2）、抗原修复：将切片浸没在盛有1×柠檬酸缓冲液（pH 6.0）的修复盒中，在微波炉中进行抗原修复。采用中火加热8分钟、停止加热8分钟、中低火加热7分钟的模式，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，避免切片干燥。修复完成后，将玻片置于PBS（pH 7.4）溶液中，在脱色摇床上振荡洗涤3次，每次5分钟。
3）、抑制内源性过氧化物酶：将切片置于3%过氧化氢溶液中，室温避光孵育25分钟。随后，将玻片置于PBS（pH 7.4）溶液中，在脱色摇床上振荡洗涤3次，每次5分钟。
4）、标记区域界定：切片经甩干后，使用组化笔在组织周围划定边界。
5）、血清封闭：滴加3%牛血清白蛋白溶液，封闭30分钟。
6）、一抗孵育：轻轻吸除封闭液，滴加稀释后的一抗，将切片平置于湿润环境中，4℃条件下孵育过夜。
7）、二抗孵育：将切片在PBS（pH 7.4）溶液中洗涤3次，每次5分钟。切片稍作干燥后，在界定区域内滴加对应HRP标记的二抗，室温孵育50分钟。
8）、DAB显色：将玻片在PBS（pH 7.4）溶液中洗涤3次，每次5分钟。切片稍作干燥后，在界定区域内滴加新鲜配制的DAB工作液，在显微镜下观察，出现适宜深浅的棕黄色阳性反应后，用水冲洗终止显色。
9）、细胞核复染：将切片置于苏木素染液中复染约3分钟，用水冲洗。接着使用苏木素分化液进行分化处理数秒，再次用水冲洗，最后用苏木素返蓝液进行返蓝操作，完成细胞核染色。
10）、脱水封片：依次将切片置于无水乙醇Ⅰ中处理5分钟——无水乙醇Ⅱ中处理5分钟——无水乙醇Ⅲ中处理5分钟——无水乙醇Ⅳ中处理5分钟——环保型脱蜡剂中处理5分钟，取出晾干后，使用中性树胶进行封片。
结果评估
理想的实验结果表现为：镜下细胞核呈现蓝色，阳性反应部位呈现深浅不一的棕色。
结果评估方法主要有两种：阳性细胞计数法和评分法。在阳性细胞计数法中，采用40倍光学显微镜，在随机选取的10个视野下统计阳性着色细胞的数量。而评分法则是在光学显微镜下，根据染色强度（0分代表无染色，1分代表淡黄色，2分代表浅褐色，3分代表深褐色）和阳性范围（1分表示0-25%，2分表示26-50%，3分表示51-75%，4分表示76-100%），对细胞进行评分，并将染色强度和阳性范围的分数相加得到最终评分。
免疫组化结果评估
1）、对照实验：与实验中设置的对照组类似，免疫组化也必须进行对照实验，缺乏对照的检测结果不可靠。通常包括阳性组织对照、阴性组织对照、阴性试剂对照和自身对照，其中至少应包含一个阳性组织和阴性组织对照。
2）、定位分析：抗原表达应出现在特定位置，例如，LCA应定位于细胞膜上，CK应位于细胞质内，PCNA和p53蛋白应位于细胞核内。若未在抗原预期部位呈现阳性染色，不能视为确切阳性结果，可能是非特异性染色或假阳性。若存在不确定性，需使用上述提到的对照实验进行验证。
3）、半定量分析：目前通常采用图像分析系统进行定量分析，但如果实验室条件有限，也可以使用肉眼进行半定量评估。免疫组化的半定量通常分为三级：弱（+）、中（++）、强（+++）。观察5-10个高倍视野（HPF），根据弱（+）=1、中（++）=2、强（+++）=3进行评分。通过计算（+）% × 1 +（++）% × 2 +（+++）% × 3得出数值，总值＜1.0为（+），1.0-1.5为（++），＞1.5为（+++）。
4）、图像分析系统：进行精确定量分析需要使用图像分析系统，有多种类型可供选择。推荐一款免费软件：Image J，该软件操作简便，功能完善，可满足一般免疫组化结果分析的需求。
05
常见问题及改进建议
常见非特异性染色问题：
1）、抗体选择：一抗使用多克隆抗体时容易出现非特异性染色，建议选用高纯度、高特异性的单克隆抗体，以针对更具特异性的抗原决定簇。
2）、抗体浓度过高/孵育时间过长：每次使用新抗体前应进行预实验，确定最佳工作浓度，不可简单按照说明书使用。另一个常见原因是孵育时间过长。解决方法是使用定时器进行精确控制。
3）、DAB染色时间过长/试剂变质：DAB的孵育时间过长会导致背景非特异性染色。DAB的显色时间并非固定不变，主要依靠在显微镜下观察，一旦出现浅浅的棕色，应立即冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。
4）、内源性酶和生物素干扰：内源性酶和生物素也会导致非特异性染色，特别是一些内源性酶和生物素含量丰富的组织，如肝脏、肾脏、脾脏等。解决方法是灭活碱性磷酸酶。
5）、组织干燥：一次处理切片数量不宜过多。确保试剂充分覆盖组织，超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围绘制边界，将修复液控制在边界内。边界距离组织边缘应为3-4 mm。
6）、浸泡时间过长：切片在缓冲液或修复液中浸泡时间不宜过长。
7）、清洗不彻底：清洗过程必须充分。PBS溶液必须使用新配制的双蒸水，使用前再次测定pH值。