科研探索者必备指南·与您同行科研的第2007天
β-Actin与GAPDH作为内参的可靠性探讨
哪种内参指标最为可靠？
免疫印迹技术（Western blotting, WB）在分子生物学领域扮演着重要角色，它广泛应用于检测生物样本中特定蛋白质的存在情况。在进行WB实验时，确保上样量的准确性至关重要，以便目标蛋白的变化具有可比性。通常情况下，会选择在所有组织中广泛分布且含量相对稳定的蛋白质作为内参（Loading control）。
内参的选择及其上样量应如何确定？哪种内参指标最为可靠？
常用内参抗体的分子量及其定位情况如下：
根据文献报道，当总蛋白上样量超过10 μg时，内参蛋白的检测灵敏度会下降，难以观察到差异：
因此，一般情况下内参的理想上样量为大约5μg。而对于目标蛋白的上样量，其理想范围通常为10-20μg：
GAPDH是一种常用于细胞质定位的内参，当使用HeLa细胞裂解液进行实验时，上样量在10-50μg范围内，实验结果显示不同上样量下GAPDH的表达水平几乎无变化：
为了验证这一现象是否具有普遍性，我们对HzAm1细胞裂解液（该裂解液涵盖了WB分析中的大部分蛋白质）进行了实验，上样量范围设置为4-40μg，PVDF膜经ECL化学发光检测后，发现当总蛋白质上样量超过4μg时，β-Actin条带的强度变化不明显：
为了实现数据的标准化，当前许多SCI期刊的审稿人要求在每个目标蛋白条带上进行内参孵育。然而，从上述β-Actin与GAPDH的实验结果来看，我们有理由对这一要求的合理性提出质疑！
因此，我们采用抗TCTP（翻译控制的肿瘤蛋白）抗体和抗GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）抗体进行进一步验证，结果显示TCTP与GSK-3β的信号强度随着上样量的增加呈现近似线性的关系，而此时β-Actin的信号强度几乎不受上样量变化的影响：
上述结果表明，使用β-Actin重新检测同一张膜以实现数据标准化的传统方法应当受到重新评估。那么，为什么会出现上述现象呢？
这种现象主要归因于β-Actin的高丰度，其含量远超细胞中的其他大多数蛋白质。这一特点导致β-Actin经常出现超载现象，特别是在检测低丰度蛋白质时，难以区分蛋白质上样量的差异。为了进一步验证β-Actin的适用范围，我们在低于4μg的范围内对样品进行连续稀释并进行分析（方形折线代表理论含量，圆形折线代表实际检测情况）：
实验结果显示，在0.7-1.9μg的范围内，β-Actin的条带强度逐渐增加，这与蛋白质上样量呈现良好的对应关系。而在2.2-40μg的总蛋白上样量范围内，β-Actin的条带强度没有明显变化，这一结果说明随着上样量的增加，实际值与理论值之间的差异逐渐增大。例如，当总蛋白上样量增加到40μg时，这种差异可能超过10倍。
针对上述问题，研究者提出了一些解决方案，例如使用丽春红染色（Ponceau staining）或考马斯亮蓝染色（Coomassie staining）作为替代内参进行数据标准化。当然，也有文献采用了这种方法，例如：
丽春红染色和考马斯亮蓝染色作为内参的优势在于它们不依赖于单一蛋白质，因此可以消除特定条件下单个管家蛋白变化的影响。
然而，这些方法仍然存在许多局限性。丽春红染色总蛋白的光密度值在μg范围内近似线性，而马斯亮蓝染色高达20μg，但实际蛋白上样量往往远高于理论值，这将导致样品之间蛋白质水平的倍数变化被缩小甚至减小。
此外，由于丽春红染色强度的高度时间依赖性以及考马斯亮蓝染色在硝化纤维素膜上产生的高背景，这些方法的复现性较差，降低了它们作为内参的吸引力。
Stain-free总蛋白定量是一种新兴的总蛋白归一化方法，它通过直接对每一条泳道的所有蛋白质进行定量，从而避免了各种内参的局限性。与丽春红染色和考马斯亮蓝染色相比，Stain-free总蛋白定量结果更接近理论值，因此强烈推荐此方法！
在此，我们使用Stain-free总蛋白定量方法对大鼠心脏匀浆中的总蛋白进行定量，实验结果表明Stain-free总蛋白定量能够准确反映每个通道中的蛋白质量，可作为WB的可靠内参：
上图展示的Stain-Free™免染胶购自Bio-Rad公司，有兴趣的朋友可以自行查找。接下来，我们对WB检测到的蛋白酶体亚基Rpt1进行归一化处理，归一化后Rpt1的表达水平保持稳定：
肝脏裂解物(10-45μg) Stain free gel在使用紫外活化2分钟后，与丽春红S染色液相比，Stain free法定量结果更加准确：
值得注意的是，Stain free转膜后的NC膜成像时必须在湿润条件下进行，否则获得的图像质量会明显下降：
综上所述，内参抗体在线性范围内才能更好地反映蛋白上样量，因此上样量对于内参和目标蛋白都至关重要。Stain-free总蛋白定量方法由于其准确性和便捷性，可作为我们WB内参定量的金标准！希望今天的分享对大家有所帮助，谢谢大家！
参考文献：
1. Chen, W. & Xu, W. H. β-Actin as a loading control: Less than 2 μg of total protein should be loaded. Electrophoresis 36, 2046–2049 (2015).
2. Moritz, C. P. Tubulin or Not Tubulin: Heading Toward Total Protein Staining as Loading Control in Western Blots. Proteomics 17, (2017).
3. Gilda J.E., Gomes A.V. (2015) Western Blotting Using In-Gel Protein Labeling as a Normalization Control: Stain-Free Technology. In: Posch A. (eds) Proteomic Profiling. Methods in Molecular Biology, vol 1295. Humana Press, New York, NY.
4. Gilda, J. E. & Gomes, A. V. Stain-Free total protein staining is a superior loading control to b-actin for Western blots. Analytical Biochemistry 440, – (2013).
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