【实验目的】
（1）深入了解蓝白斑筛选的原理及操作流程。
（2）掌握通过蓝白斑筛选鉴定重组DNA的方法和步骤。
【实验原理】
蓝白斑筛选是一种重组子筛选的方法，它在抗生素筛选的基础上进行第二次筛选，主要是通过载体的遗传特征来识别重组子。载体中通常包含大肠杆菌DNA的短片段，这个片段带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列以及前146个氨基酸的编码信息。在多克隆位点插入外源DNA后，会影响β-半乳糖苷酶的活性。当宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间存在互补关系时，即α-互补，会产生蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，会产生无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
【实验材料、试剂及仪器】
实验材料：经过转化处理，并加入LB液体培养基培养的大肠杆菌。
实验试剂：
1. X-gal：溶于二甲基甲酰胺，浓度为20mg/mL，避光贮存于-20°C。
2. IPTG：溶于双蒸水，浓度为2g/10mL，过滤除菌后贮存。
3. TE缓冲液：高压灭菌后的Tris-HCl和EDTA混合溶液。
4. 抗生素溶液：包括氨苄青霉素或卡那霉素。
实验仪器：超净工作台、恒温水浴锅、恒温摇床、台式低温高速离心机、锥形瓶、玻璃涂棒、培养皿等。
【实验步骤】
1. 在LB固体培养基冷却至适宜温度时，加入相应抗生素，并倒入培养皿中，待其凝固后保存于4°C。
2. 在含有抗生素的LB琼脂平板上，均匀涂上X-gal和IPTG溶液。
3. 将转化后的感受态细胞均匀涂布在培养皿上，待液体被吸收后，放置于37°C培养箱中培养。
4. 倒置培养皿，于37°C下培养12-16小时，观察菌落颜色。白色菌落为重组DNA质粒，蓝色菌落为空载体。
【典型实验结果分析】
经过12-16小时的培养，在培养皿上会出现白色菌落和蓝色菌落。白色菌落代表DNA重组子，而蓝色菌落则代表空载体。这一结果直观地展示了蓝白斑筛选的效果。
【注意事项】
1. 需要进一步鉴定白色菌落中的重组质粒是否含有目的片段。
2. 整个操作过程需要注意避免外来DNA的污染。
3. 当插入的PCR片段较短且未影响lacZ基因的阅读框时，可能出现的菌落为蓝色。
4. 抗生素应在培养基冷却至50-60°C时添加，以避免抗生素失活。
5. 涂抹IPTG和X-gal时需确保均匀涂布，以保证实验结果的准确性。
